今天推送的文章发表在ACSCatalysis的“DesigningASSMDStrategyforExploringandEngineeringExtremeThermophilicAncestralNitrilaseforNitrilesBiocatalysis”，通讯作者为江南大学的陆震鸣和龚劲松。

采用祖先序列重建方法复活已灭绝的耐热酶是一种值得称赞和有效的策略。大量的祖先酶存在于进化景观中的多个分支中。一些研究采用分子动力学模拟技术结合祖先酶重建，深入探索酶的动态分子信息。利用对与这些祖先酶相关的分子细节的深刻理解，可能有助于在极端微生物中靶向发现这些祖先酶。

在本研究中，为了揭示进化景观的分子水平信息，作者设计了一个构建祖先酶序列结构动力学参数库的工作流程，称为ASSMD策略（图1）。该策略用于发现嗜热腈水解酶，它可以催化腈化合物水解成羧酸。首先，使用系统发育树分析腈水解酶的进化历史，以创建祖先酶序列库，其中包括69个代表根和分支祖先的序列。基于ASSMD策略，腈水解酶进化景观中存在一个动态灵活性低谷（该地区祖先腈水解酶的RMSD值明显低于其他地区），包括七种祖先酶。对这些祖先酶进行了实验表征，发现了一种极端嗜热的祖先ASR135，能够承受高达90°C的温度。为了更深入地了解其进化信息，通过结合能量计算和实验室进化，对其进化进行了进一步分析。进一步增强了ASR135的热稳定性，获得了突变体ASR135-M4，即使在100°C下也表现出水解活性。进一步的研究表明，ASR135-M4在经过实验室进化以提高其热稳定性后，在其结构中表现出额外的盐桥、氢键、π-烷基相互作用四面体笼和增强的疏水核。

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设计ASSMD策略挖掘进化景观中祖先酶的分子信息

作者开发了一个工作流程，用于收集进化景观中所有祖先酶的分子信息，作为发现新酶的指南。进化树被证明可以有效地描绘酶的进化景观，每个祖先酶都位于树上的分支点（图1A）。这些祖先酶已经灭绝，但可以利用祖先酶重建技术来推断进化景观中所有祖先酶的氨基酸序列，获得对这些祖先酶的主要结构信息（图1B）。由于在氨基酸序列水平上获得的信息本身是有限的。为了克服这些局限性，作者利用获得祖先酶的3D结构，并建立这些祖先酶的全面蛋白质结构库（图1C）。最后，为了模拟祖先酶的工作环境，对每个祖先酶结构进行了分子动力学模拟，收集了祖先酶的动态轨迹和参数，建立一个动态参数库，用于揭示祖先酶的生化特征（图1D，E）。该工作流程被称为ASSMD策略。

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基于ASSMD策略发现极端嗜热祖先腈水解酶

鉴于腈水解酶在腈水解催化中的强大应用特性，它们被选为研究模板。从数据库中筛选了来自不同物种的71个腈水解酶序列，以构建进化景观（图1A）。基于上述ASSMD策略（图1）建立了腈水解酶的祖先酶序列结构分子动力学参数库（69个祖先酶）。在进化景观中祖先酶的分子动力学模拟过程中，RMSD值的总体收敛趋势接近约0.76nm（图2B）。然而，在一组特定的进化分支中（图2A），七种祖先酶的RMSD收敛值明显低于总体趋势，存在一个动态的灵活性槽（图2）。这表明，在这个动态柔性槽中的这七种祖先酶表现出显著的结构刚性。推测它们可能经历了极端的环境条件，在这个动态柔性槽中可以挖掘出极端的嗜热酶。因此对所有七种祖先酶进行了后续实验。

这七种祖先酶在大肠杆菌中成功异源表达，并对其酶活性进行了表征。结果表明，除ASR131和ASR133外，五种祖先酶均表现出酶活性（图3）。在ASR135在90°C下孵育10分钟后，酶活性保留了11.69%，而其他六种祖先酶在相同条件下失去了所有酶活性（图3A）。这表明ASR135具有极高的耐热性。基于耐高温性和酶活性，选择ASR135作为研究对象。

随后研究了导致ASR135极端耐热性的进化事件。首先追踪了从ASR134（ASR135的祖先）到ASR135，再到现有的腈水解酶BbNit和PpNit的进化路径，将其作为一个单一进化事件（图4A）。在进化过程中，四种腈水解酶在三个不同时间的序列积累了许多突变，整体序列同一性仅为89%。ASR135的祖先ASR134表现出较差的热稳定性，其在40°C下的半衰期仅为16.86h。ASR135在40°C下的半衰期是ASR134的13.01倍，达到219.39h（图3C）。BbNit和PpNit的热稳定性显著降低，在40°C下的半衰期分别仅为ASR135的23%和11%（图3C）。此外，ASR135的熔化温度（Tm）为80.57°C，明显高于其祖先ASR134（68.03°C）及其后代BbNit（74.06°C）和PpNit（71.41°C）。这表明ASR135是从低热稳定性的ASR134进化而来的，随着时间的推移逐渐失去极端的嗜热特性，并进化成现有的形式。因此，ASR135可能因其宿主物种经历极端高温环境而进化出极端的热稳定性。最佳反应温度表明，ASR134（50°C）、BbNit（60°C）和PpNit（60°C）都表现出中温性。相比之下，ASR135显示出明显更高的最佳反应温度80°C，并且发现ASR135在80°C下的酶活性比30°C高12倍，表明其具有明显的嗜热特性（图3D）。

此外，作者还表征了进化景观中动态柔性槽外祖先酶的热稳定性，并选择了六种具有代表性的祖先酶（图2）。对其热稳定性进行表征，六种祖先酶的最大半衰期和Tm值分别仅为58.79小时和72.84°C。这一系列热稳定性数据表明，通过ASSMD策略在分子动力学水平上分析进化景观并定位动态柔性槽以挖掘具有高热稳定性的祖先酶的方法是可靠的。值得注意的是，在进化景观中发现的祖先酶位于进化树的末端分支附近。这与之前的研究不同，之前的研究主要集中在进化树根部的祖先，强调了高性能的祖先酶并不完全位于根部。

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改进ASR135的热稳定性

实验结果和分析表明，在ASR135的进化事件中，热稳定性呈现出先增加后降低的趋势（图4A）。并非在从ASR134进化到ASR135的过程中发生的所有氨基酸序列突变都必然有助于提高自然条件下的热稳定性。此外，在ASR135演变为其现有形式BbNit和PpNit的过程中，观察到热稳定性降低；并非所有天然氨基酸突变都必然有利于热稳定性（图4A）。尽管ASR135的热稳定性明显高于ASR134、PpNit和BbNit，但后三种腈水解酶可能具有残基位点，这可以进一步提高ASR135在这一进化事件中的热稳定性。在这项研究中，这些位点被定义为ASR135热稳定性有益残留位点（TBRS）。

为了识别这些TBRS，作者将其分为三个步骤：多序列比对、能量计算和突变体实验验证。最初，基于ASR135与ASR134、BbNit和PpNit的多重序列比对，确定了这一进化事件中的非同源氨基酸残基。然后，基于不同的非同源氨基酸残基，利用RosettaCartesian_ddg构建了55个虚拟单点突变体，并计算了55个单点突变的ΔΔΔGfold值（图4B）。理论上，负ΔΔGfold值表明对蛋白质折叠和稳定性有有益影响。在55个虚拟单突变体中，选择了40个ΔΔGfold值为负的突变位点，将这40个突变位点引入ASR135进行实验验证。考虑到计算准确性的局限性，连续的多点突变以及氨基酸插入和缺失都是直接通过实验验证的。因此，本实验共构建了48个突变体（图4C，D）。

ASR135突变体的热稳定性通过在90°C下孵育10分钟后的残余酶活性来表征（图4C）。为了获得高性能突变体，还对野生型ASR135（ASR135-WT）的相对酶活性进行了表征（图4D）。在这些突变体中，有四个突变体表现出提高的热稳定性和相对酶活性，即S97E、S101A、N124H和H155Y（图5A）。随后，为了实现协同增强，基于这四个突变体构建了六个双突变体、两个三突变体和一个四突变体。实验结果表明，这些突变体之间存在显著的协同效应。突变体S97E/S101A/N124H/H155Y（ASR135-M4）表现出非常稳健的性能（图5B）。与ASR135-WT相比，ASR135-M4的残留酶活性从11.69%增加到43.23%（图5B）。此外，与ASR135-WT相比，ASR135-M4的Tm值增加了6.2°C，达到86.77°C。值得注意的是，在100°C的条件下，ASR135-M4保持了催化活性，酶活性为5.82U·mL-1（图5C-F），而ASR135-WT在100°C的反应条件下无法进行酶反应（图5D）。

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理解ASR135-M4增强蛋白质稳定性的分子机制

为了更深入地了解ASR135-M4增强热稳定性的分子机制，作者对预测的3D结构以及ASR135-WT（野生型）和ASR135-M4的残基相互作用进行了分析和计算。ASR135-M4突变体中101位的丝氨酸突变为丙氨酸，疏水核内的疏水相互作用得到了加强，从而提高了腈水解酶的热稳定性（图6K，L）。

ASR135-WT中丝氨酸残基97突变为谷氨酸后，E97和K34之间形成了额外的盐桥相互作用（图6A，E）。此外，E97和K34位于两个独立的α-螺旋二级结构中（图6A，E）,这使得这两个α-螺旋的3D结构更加稳定。此外，由于ASR135-WT的N124和D122之间的氢键相互作用，N124有远离α-螺旋a的趋势（图6B）。分子动力学模拟轨迹分析发现，当N124被组氨酸取代时，H124与α-螺旋a中的R96残基形成平均长度为2.55Å的氢键相互作用，这进一步增强了α-螺旋的结构刚性（图6B，F）。H155突变为酪氨酸后，酪氨酸残基的苯环侧链与I120、A129和A153残基的烷基侧链形成了三个π-烷基相互作用（图6C，G）。这四个氨基酸残基充当顶点，三个π-烷基相互作用充当边，形成四面体笼结构（图6C，G，J）。由于相互作用笼的形成，这使得这四个氨基酸残基的结构更加稳定。

分子动力学模拟的进一步分析表明，与ASR135-WT相比，ASR135-M4中与α-螺旋A、β-折叠1、β-折叠2和β-折叠3对应的残基区域的相应RMSF值显著降低（图6M）。这些可以进一步证明，在S97E、N124H和H155Y突变后，由于上述各种相互作用的引入，相应二级结构区域的灵活性降低，ASR135的刚性和热稳定性大大增强。

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对ASR135-M4底物谱的探索

为了探索其在生物催化领域的应用潜力，作者探索了ASR135-M4的底物范围。结果表明，ASR135-M4具有较宽的底物谱，对18种选定的腈化合物具有酶活性。ASR135-M4的底物范围与ASR135-WT的底物范围高度一致。ASR135-M4对芳香腈表现出明显的底物偏好，对五种特定化合物（1、2、4、6和8）表现出显著的酶活性。为了更深入地了解ASR135-M4的芳香腈底物偏好机制，作者选择了芳香腈模型底物3-氰基吡啶和脂肪族腈模型底物丁腈。随后，将两个模型底物对接到ASR135-M4的活性口袋中，并进行分子动力学模拟。

腈水解酶通过活性中心催化三联体E48-K133-C168催化底物腈产生相应的有机酸和氨。残基C168的Sγ原子亲核攻击底物氰基C原子，形成相应的四面体中间体。因此，计算了MD期间残基C168的Sγ原子与两个底物的氰基C原子之间的距离（图8）。结果表明，3-氰基吡啶的氰基C原子与C168Sγ原子之间的距离分布在200ns内相对稳定（图8）。相比之下，丁腈的距离分布显示出明显的波动（图8H）。接下来从MD轨迹中每8ns提取一次子序列ASR135-M4复合结构。叠加提取的结构后，发现芳香腈底物3-氰基吡啶与活性口袋的结合位相对稳定，而丁腈与活性口袋之间的结合位则相对不稳定（图8A，D）。基于相互作用分析和分子动力学模拟，发现由于芳香环存在于3-氰基吡啶结构中，它与F205（平均长度：6.38Å）和Y54（平均长度为6.01Å）形成π-π堆叠相互作用，与M195（平均长度：4.39Å）发生π-硫相互作用，以及与L197（平均长度）和P193的π-烷基相互作用。而脂肪族腈-丁腈结构没有这种复杂的π型相互作用，因为没有芳香环结构（图8）。这使得3-氰基吡啶的构象比丁腈更单一、更稳定，丁腈在更多方向上通过相互作用被拉伸。

进一步的分析表明，3-氰基吡啶的氰基C原子和C168的Sγ原子之间的距离分布在4.4至5.2Å之间仅显示一个单峰（图8C）。在该峰范围内，3-氰基吡啶通常与活性中心残基C168呈“点对”构象（底物氰基C原子指向催化残基C168）（图8C）。这种构象使底物有利于C168的亲核攻击。然而，丁腈的相应距离分布显示出两个峰区，即3.6-4.4Å和6.4-7.4Å（图8F）。尽管从峰到丁腈的距离较小的区域也表现出“点对”构象，但峰较大的区域表现出“反向”构象（底物氰基C原子回到催化残基C168），并且占据了更大的比例（图8F）。与脂肪族腈相比，芳香族腈底物3-氰基吡啶更有可能被ASR135-M4活性袋中的催化残基C168亲核攻击，因为它倾向于显示“点对”构象。这可以解释ASR135-M4对芳香腈底物表现出显著偏好的分子机制。