编译：微科盟梅子，编辑：微科盟景行、江舜尧。

导读

论文ID

原名：Multi-omicsanalysisofsmallRNA,transcriptome,anddegradometoidentifyputativemiRNAslinkedtoMeJAregulatedandoridoninbiosynthesisinIsodonrubescens

译名：冬凌草小RNA、转录组和降解组的多组学分析确定了与MeJA调节和冬凌草甲素生物合成相关的假定miRNAs

期刊：InternationalJournalofBiologicalMacromolecules

IF：8.2

发表时间：2023年12月

DOI号：10.1016/

实验设计

结果

1小RNA测序技术概述

为了全面鉴定冬凌草，并确定参与冬凌草甲素生物合成的miRNA对MeJA的响应，研究者从JY基因型（含冬凌草甲素）和LS基因型（不含冬凌草甲素）经MeJA处理或未处理的叶片中提取了12个sRNA文库、分别命名为JY_M0h1、JY_M0h2、JY_M0h3、JY_M3h1、JY_M3h2、JY_M3h3、LS_M0h1、LS_M0h2、LS_M0h3、LS_M3h1、LS_M3h2和LS_M3h3。测序后，共获得8289001至17899577个原始读数和4299777至10240103个纯净读数。研究者利用与Genbank和Rfam数据库的blastn和blastall比对，将小RNA注释到对MeJA有不同反应的冬凌草基因型。在JY文库中，最丰富的RNA类别是rRNA，平均值为3.37%，其次是tRNA（2.59%）、其他RfamRNA（0.17%）、snoRNA（0.05%）和snRNA（0.03%）。对于LS文库，注释结果类似，rRNA的代表性最高，平均值为2.68%，其次是tRNA（1.30%）、其他RfamRNA（0.14%）、snRNA（0.04%）和snoRNA（0.04%）（表1）。

不同长度的sRNA具有不同的功能。21-ntsRNAs主要在转录后基因沉默中发挥作用，而24-ntsRNAs通常通过异染色质维持或RNA依赖性DNA甲基化诱导基因沉默。在分析18至25nt长度的小RNA分布时，采用了干净的读数，其中21至24nt长度的sRNA数量最多（74.82%-90.00%）。然而，两组文库（JY文库和LS文库）的小RNA分布却有所不同（图1）。在JY文库中，长度为24nt的sRNA数量最多（占26.96%），21nt的sRNA数量在所有文库中位居第二（占26.64%）（图1A）。相比之下，在LS文库中，长度为21nt的sRNA数量最多（31.43%），明显高于第二多的长度为24nt的sRNA（24.84%）（图1B）。这一差异表明，不同基因型的冬凌草的sRNA存在功能差异。总之，这些结果表明在不同基因型的冬凌草中存在复杂多样的sRNA群体。此外，sRNA作为表观遗传调控因子，为研究不同地区中药的遗传机制奠定了基础。

图1.冬凌草不同文库中独特小RNA的长度分布。

表1.冬凌草不同文库中的小RNA分类。

2通过sRNA测序鉴定miRNA

为了鉴定miRNA，研究者将干净序列标签与miRBase数据库中保存的所有植物miRNA成熟序列进行了比对。通过对属于99个科的12个文库进行测序，共获得287个已知miRNA（表S2）。miR156是最大的家族，有18个成员，其次是miR396和miR171，分别有16和15个成员（图2A，表S2）。此外，还研究了保守miRNA的丰度。在所有文库的34个miRNA中，有20个miRNA家族的读数丰度超过1000。相比之下，只有9个miRNA的读数丰度超过10000个，52.96%的miRNA的读数丰度低于10个（表S2）。在鉴定了已知的miRNA后，研究者根据miREvo和miRdeep2标准鉴定了新型miRNA（表S3）。总共鉴定出61个新型miRNA，只有4个新型miRNA的读数丰度超过10000，分别命名为PC-3p-4_1276478、PC-3p-14_301914、PC-3p-122_22955和PC-5p-216_13956（表S3）。此外，还进行了核苷酸偏倚分析，在所有miRNA中，共有51.42%的第一个核苷酸偏倚为U，其次是A（21.93%）、C（16.27%）和G（10.38%）（图2B）。在长度为18至23nt的miRNA中，U也是首选的第一个碱基，而在长度为24nt的miRNA中，首选的第一个碱基是A（图2C）。miRNA序列的这些特征与已知的Dicer处理特异性相吻合。

研究者评估了整个文库的miRNA分布情况，发现JY和LS基因型的对照组和MeJA处理组样本共有145个miRNA（图2D）。JY_M0h组、JY_M3h组、LS_M0h组和LS_M3h组分别检测到317、283、271和288个miRNA。在JY和LS基因型中，经MeJA处理的样本的miRNA种类呈现出相反的趋势。JY基因型的miRNA种类在MeJA处理后减少，而LS基因型的miRNA种类则增加，这反映了miRNA对冬凌草基因型的反应。研究者分别比较各基因型，JY基因型的对照样本和MeJA样本共有10个miRNA，mes-MIR167gp3、mtr-miR156e_1ss21CT和nta-MIR159-p5_2ss8GA18TC等26个miRNA是JY_M0h植株所特有的，而PC-3p-259822_16、PC-3p-256709_16等2个miRNA只在JY_M3h植株中表达。在LS基因型中，sly-miR167b-3p_R-3_1ss10AG、ly-miR395b-5p_1ss9TC和mtr-MIR166b-p5_1ss9GT等5个miRNA只在LS_M0h植株中表达、而mtr-miR172a_1ss21GT、mtr-miR398a-3p_R-1和aly-MIR857-p3_2ss11GC22AT等10个miRNA在MeJA处理后表达。此外，在LS基因型中，有11个miRNA在对照组和MeJA处理之间普遍表达（图2D）。

图2.通过sRNA测序分析已知和新型miRNA。A：前20个已知miRNA家族；B：miRNA总核苷酸偏倚；C：不同长度miRNA的第一个核苷酸偏倚百分比；D：四组文库的韦恩图。

3miRNA的表达分析

研究者基于foldchange（≥1或≤1）和P/q值（＜0.05）阈值，鉴定出348个miRNA中共有51个（14.66%）表达显著（图3A，表S4）。研究者对四组上调和下调的miRNA进行配对比较。其中，JY_M0h组vsLS_M0h组的显著miRNA数量最多（图3B，C）。与MeJA处理组相比，JY基因型产生了有27个miRNA对MeJA有反应，13个差异表达的miRNA（5个上调，8个下调），包括aly-MIR845ap5_2ss3CT21AT、mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC，在LS基因型中有15个差异miRNA（7个上调，8个下调），包括sly-miR167b-3p_R-3_1ss10AG,ppe-MIR171e-p3_2ss10GC20CT和stu-miR482a-3p_1ss8TC（图3D）。3D，表S5）。然而，只有1个miRNA（mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC）在JY__M3h组和LS_M0h与LS_M3h组之间表现出共同的差异。这一结果表明不同基因型的冬凌草对MeJA的反应模式存在差异。在不同基因型分析中，JY_M0h组vsLS_M0h组有34个差异表达的miRNA（14个上调，20个下调），包括mtr-miR172c-5p、PC-3p-49776_106和mtrmiR159a_R-2。与LS_M0h相比，JY_M3h中有23个不同表达的miRNA（8个上调，15个下调），包括PC-5p-444_6890、mtr-MIR168c-p3和gma-miR160a-3p（表S6）。此外，在（JY_M0hvsJY_M3h）vs.（LS_M0hvsLS_M3h）vs（JY_M0hvsLS_M0h）vs（JY_M3hvsLS_M3h）的比较中，mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC也是常见的miRNA（图3C）。这表明mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC在调节冬凌草基因型差异的同时，也对MeJA作出了反应。

图3.冬凌草的miRNA表达分析。(A）冬凌草中显著差异表达miRNA的热图。(B)不同比较组中上调和下调表达明显不同的miRNA的数量，P值＜0.01，P值＜0.05。(C)JY_M0hvsJY_M3h、LS_M0hvsLS_M3h、JY_M0hvsLS_M0h和JY_M3hvsLS_M3h的韦恩图分析。(D)JY和LS基因型对MeJA的反应中表达的miRNA的显著差异热图。

4靶标预测和降解组分析

研究者利用psRNATarget服务器（）预测miRNA靶向转录本。结果共得到49180个miRNA-靶基因对，包括17846个靶基因，这些基因被331个miRNA靶向（表S7）。其中，期望值≤5，期望值越低，靶向关系越好的靶基因有163、141、270、488、863、1315、2770、6033、10、10705、29、13702、77和12641个，期望值分别为0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、3.75、4.00、4.25、4.50、4.75和5.00（表S7）。此外，这些靶标主要是转录因子、植物激素信号转导蛋白和植物与病原体相互作用蛋白。

表2.冬凌草降解测序数据汇总。

研究者还利用降解组测序来鉴定miRNA靶标。测序后，共获得30858869个原始读数和7097001个唯一原始读数（表2）。干净的读数被映射到冬凌草转录组数据库的参考数据库（NCBISequenceReadArchive：PRJNA910296）。在43115个输入转录本中，共确定了25672131个映射读数（83.19%）和34634个覆盖转录本（80.33%）（表2）。使用管道预测后，3066个靶标基因中的3066个裂解位点与228个（65.5%）miRNA相关，包括33个新的miRNA（240个靶标基因）和195个已知的miRNA（2826个靶标基因）（表S8）。先前的研究表明，一个miRNA可以靶向多个靶基因，同样，一个靶基因也可以被多个miRNA靶向。在本研究中，mtr-miR172c-5p_R-3预测的靶基因数量最多，确定了94个靶基因，其次是mtr-MIR396b-p5_2ss18AT19CT（91个靶基因）和mtr-MIR2603-p3_2ss9AC17AC（78个靶基因）。在新型miRNA中，PC-3p-14_301914的靶基因数最多，有33个靶基因，其次是PC-5p-141047_35（23个靶基因）和PC-5p-137561_36（23个靶基因）。研究者绘制了检测到靶基因数量最多的前25个miRNA（图S1）。此外，在降解组p值小于0.05的情况下，在裂解位点预测出了156个特定的miRNA-mRNA对（表S8）。为了确定裂解位点，根据mRNA位置上的峰高将降解组峰分为五类，并评估0类或1类中最重要的靶标基因。在降解组结果中，第0类发现了111个靶基因，其中大部分与转录因子有关，如SPL、ARF和NAC，被miR156、miR858、miR167和miR164家族裂解（表S8）。第1类，共有14个基因被13个miRNAs（包括miR482、miR6454和PC-3p-14_301914家族）裂解。在第2类中，发现了四种主要与植物激素信号转导相关的mRNA，如SPL12、TIR1、SCL6和AFB2。这些靶基因分别被sslmiR156_R-1、stu-miR393-5p_L+1R-1、gma-miR171k-3p和mtrmiR393a_L+1R-4裂解（表S8）。其余7个靶标基因属于第3类，包括同源染色体-亮氨酸拉链蛋白、泛素蛋白连接酶和生长调节因子，分别被miR166a-3p_L+2R-2、MIR2603-p3_2ss9AC17AC和miR396a-5p_L+3_1ss24GA裂解。

5GO富集和KEGG途径分析

为了更好地了解miRNAs的功能，研究者利用GO数据库对冬凌草中所有miRNAs的靶标进行了GO富集分析。降解组数据中共有2308个基因被2549个GO_术语富集，分为1388个生物过程、808个分子功能和353个细胞组分（表S9）。在生物过程方面，靶标数最高的前四个术语分别是生物过程（biological_process，247）、转录调控（regulationoftranscription，DNA-templated，228）、转录（transcription，DNA-templated，199）和防御反应（defenseresponse，98）。在分子功能方面，蛋白质结合（339）、分子功能（208）、ATP结合（204）和DNA结合（201）是最多的类别。常见的细胞成分术语有细胞核（752）、细胞质（392）、质膜（343）和叶绿体（297）（图4A，表S9）。在p值小于0.05的情况下，共鉴定出231个显著富集的GO_术语，其中包括141个生物过程、59个分子功能和29个细胞成分。图4B中突出显示了20个最富集的GO术语（表S9）。此外，还对51个差异显著的miRNA的靶基因进行了GO富集分析。其中，45个显著差异miRNAs共鉴定出564个靶基因，564个靶基因富集了1116个GO_术语。靶标基因数量最多的前四个术语是生物过程类中的转录调控、DNA-模板（57）、转录、DNA-模板（53）、生物过程（46）和氧化还原过程（20）；细胞组分类别中的细胞核（168）、细胞质（88）、叶绿体（85）和质膜（73）；分子功能类别中的蛋白质结合（76）、DNA结合转录因子活性（57）、DNA结合（52）和ATP结合（45）（表S10）。

图4.降解组数据的GO富集分析。(A）GO富集度最高的直方图分析。(B)P值小于0.05的前20个GO富集的散点图分析。

研究者使用KEGG（京都基因和基因组百科全书）进行了通路注释分析。降解组数据中共有956个基因被注释到128个KEGG通路中，并被分为6类，包括生物系统（113个基因）、新陈代谢（581个基因）、遗传信息处理（307个基因）、环境信息处理（97个基因）、细胞过程（67个基因）和其他（55个基因）（图5）。基因数量最多的KEGG通路是植物-病原体相互作用（101个基因）、植物激素信号转导（73个基因）和RNA运输（48个基因）（表S10）。此外，还发现了15个P值小于0.05的KEGG通路，包括植物激素信号转导（73个）、剪接体（46个）和丙酸代谢（12个）（表S11）。图5B列出了20条最富集的KEGG通路（表S10）。此外，45个差异显著的miRNA所靶向的564个靶标基因被注释到97个KEGG通路中。数量最多的前6个KEGG通路分别是植物激素信号转导（21）、内质网蛋白质加工（16）、RNA转运（14）、剪接体（13）、淀粉和蔗糖代谢（12）以及植物病原体相互作用（11）（表S10）。

图5.降解组数据的KEGG富集分析。(A)KEGG通路分类的直方图分析。(B)基于P值的前20个KEGG通路富集的散点图分析。

在这些通路中，萜类化合物代谢有16个靶基因，包括萜类化合物骨架的生物合成（7）、泛醌和其他萜类化合物-醌的生物合成（6）、倍半萜类和三萜类化合物的生物合成（2）、单萜类化合物的生物合成（1）。这些基因被多个miRNAs靶向，包括miR397、MIR5368、MIR828b、MIR393b、MIR7808、MIR12112、MIR5638a、miR167、miR172c、miR396a、miR172c、miR399d和PC-3p-5275_738（表S8）。此外，植物激素信号转导通路（ko04075）由73个靶基因代表，包含可被MeJA处理诱导的茉莉酸、脱落酸、生长素、乙烯和黄铜类固醇相关信号转导基因。这些基因包括辅助因子反应因子（ARF）、辅助因子反应蛋白（IAA）、AUXINSIGNALINGF-BOX（AFB）和磷酸酶2C（PP2C），受61个miRNAs（包括miR160、miR393、miR167和miR156）调控（图6，表S11）。例如，在茉莉酸合成途径中，茉莉酸ZIM结构域（JAZ）、茉莉酸-氨基合成酶JAR1和转录因子MYC2基因被富集，这些基因被MIR408、miR172c、MIR2603、miR393、miR394a、MIR7808和PC-5p-969_3165靶向（图6）。

图6.植物激素信号转导途径与相关miRNA。

6miRNA表达的qPCR验证

qPCR分析是为了验证从小规模RNA测序中获得的miRNA的表达模式。研究者随机选取了12个miRNA，包括4个新型miRNA和5个已知miRNA，通过qPCR对所有4个样本进行验证。与高通量测序相比，大多数样本的qPCR分析都观察到了类似的miRNA表达趋势（上调或下调）（图7）。

图7.通过qRT-PCR验证随机选择的部分已知和新型miRNA的相对表达水平。以U6sRNA为内参进行了定量实时PCR；JY0h处理中的表达量设为1（四重复的平均值±SD）。

7多组学分析：MeJA调控和基因型依赖的miRNA-mRNA模块

研究者结合多种组学方法，包括小RNA、转录组和降解组测序进行分析，确定了MeJA调控的miRNA-mRNA对（JY_M3hvsJY_M0h，LS_M3hvsLS_M0h）（图8，表S13）。在JY_M3hvsLS_M0h比较组中，有10个miRNA-mRNA对，包括4个显著不同的miRNA（mes-miR394a_L+1_1ss16AG、ptc-miR167f-3p_L-1、mdm-MIR156wp3_2ss10TA21TC和mdm-MIR10987-p3_2ss2TC18GT）靶向10个显著不同的靶基因，并鉴定出4个具有拮抗调控模式的miRNA-mRNA对（图8A）。在LS_M3hvsLS_M0h对比组中，有17对miRNA-mRNA，包括7个显著不同的miRNA（PC-5p-141047_35、stu-MIR391-p3_2ss17GT18CT、stu-miR482a-3p_1ss8TC、sly-miR167b-3p_R-3_1ss10AG、mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC、gma-miR394a-5p和PC-3p-23343_211）靶向17个明显不同的靶基因，6个miRNA-mRNA对表现出拮抗调控模式（图8B）。此外，结合JA生物合成途径（图6），还发现了9个靶向18个mRNA的miRNA与MeJA反应有关，其中包括靶向JAR1的csi-MIR393b-p3_1ss10TC和rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA；PC-5p-969_3165targetingJAZ；mtr-MIR408-p3_2ss18GT19GA,mtr-miR172c-5p_R-3,mtr-MIR2603-p3_2ss9AC17AC,aly-miR393a-5p,gma-miR393a_L+1和gma-miR394a-5ptargetingMYC2.总之，推测有36对miRNA-mRNA参与了MeJA的调控（图8，表S13）。

此外，基因型依赖的miRNA-mRNA对（JY__M0h，JY__M3h）也被鉴定出来（图8，表S14）。在JY_M0hvsLS_M0h比较组中，有22对miRNA-mRNA，包括14个显著不同的miRNA（如csi-miR156g-3p、PC-3p-40287_130、ssl-miR166a_L+2R-2和mtr-miR159a_R-2）靶向22个显著不同的靶基因，以及11对具有拮抗调控模式的miRNA-mRNA（图8C）。在JY_M3hvsLS_M3h对比组中，有18对miRNA-mRNA，包括12个明显不同的miRNA（如gma-miR160a-3p、PC-3p-4_1276478、mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC和ptc-miR167f-3p_L-1）靶向17个明显不同的靶基因，有6对miRNA-mRNA表现出拮抗调控模式（图8D）。最终，有36对miRNA-mRNA被推测参与了基因型依赖性反应（图8，表S14）。

图8.多组学分析MeJA调控的miRNA-mRNA模块的显著差异和基因型依赖性。_M3hvsJY_M0h，_M3hvsLS_M0h，_M0hvsLS_M0h，_M3hvsLS_M3h。

8参与冬凌草甲素合成的miRNA-mRNA模块

为了预测与冬凌草甲素生物合成相关的miRNA和靶基因，研究者对降解组测序进行了研究，以确定靶向冬凌草甲素生物合成基因的miRNA。结果发现，共有7个miRNA靶向了6个与冬凌草甲素生物合成相关的基因（表3）。其中，mtr-miR397-5p_R-1、gma-MIR5368-p3_1ss2GA、mtr-miR172c-5p、stu-miR167d-3p_2ss12TA19CT、ptc-MIR828b-p5_2ss9CG19TA、csi-MIR393b-p3_1ss10TC、rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA和smiMIR12112-p3_2ss17GT18GT分别以HDS、ICMT、AACT、DXS、FPS、FPS、IspH和HMGR为靶标（表3）。此外，除了rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA（仅在JY_M3h组中表达）外，对这6个miRNA-mRNA表达模块进行了分析（图9）。从图9可以看出，miRNA和靶标基因的表达大多呈现相反的表达模式，这与miRNA切割目的基因的现象一致。

此外，研究者还利用psRNATarget服务器，基于冬凌草甲素生物合成基因和所有miRNA预测了与冬凌草甲素生物合成相关的miRNA。结果发现，共有151个miRNA被预测为51个与冬凌草甲素生物合成相关的基因的靶标（图10，表S15）。其中，一个靶标基因可被多个miRNA靶向，如TRINITY_DN13455_c0_g1(GGPS)可被20个miRNA靶向，TRINITY_DN18593_c0_g1(FPS)可被18个miRNA靶向，TRINITY_DN12712_c0_g1(IPP)可被15个miRNA靶向。同样，一个miRNA可以靶向多个靶标基因，如aly-MIR408-p5_2ss13TA18CT靶向14个基因，ptc-MIR167b-p3_2ss13AG17AG靶向12个基因、mdm-MIR169g-p3_2ss16CT18GC和mes-MIR171lp5_2ss15CT17AT靶向10个基因，gma-miR156b_L+1R-1_1ss20AC靶向8个基因。由此推测，miR408、miR167、miR169、miR171和miR156可能在冬凌草甲素的生物合成过程中起着重要的调控作用。此外，有24个新的miRNAs被预测为靶向冬凌草甲素生物合成的相关基因，包括PC-5p-791607_4、PC-5p-141047_35、PC-3p-326069_12、PC-5p-175906_26、PC-3p-929800_3和PC-3p-256709_16（表S13）。结合降解测序的结果，mtr-miR397-5p_R-1TRINITY_DN12513_c0_g1（HDS），mtr-miR172c-5pTRINITY_DN18321_c0_g2（AACT），stu-miR167d-3p_2ss12TA19CTTRINITY_DN18459_c0_g2（DXS），ptc-MIR828b-p5_2ss9CG19TATRINITY_DN18593_c0_g1（FPS）模块在降解组测序和psRNATarget中都检测到了，表明这些miRNAs参与了冬凌草甲素生物合成的调控。

表3.通过降解测序预测靶向冬凌草甲素生物合成相关基因的miRNAs。

图9.通过降解组测序预测参与冬凌草甲素生物合成的miRNA-mRNAModules的表达模式。miRNA和mRNA的表达数据来自测序。在JY_M0h中的表达被设为1（四重复的平均值±SD）。

图10.根据psRNATarget预测的与冬凌草甲素生物合成途径相关的miRNA及其靶标之间的关系。大多数miRNA靶标被选中映射到这一途径中，但期望值较低。

9miRNA-mRNA模块表达的qPCR验证

为了验证miRNA-mRNA模块结果的可靠性，研究者进行了qPCR分析以确认miRNA-mRNA模块的表达模式（图11）。研究人员随机选择了8个miRNA-mRNA模块，包括一些与冬凌草甲素生物合成相关的模块对，在JY株系或LS株系中进行qPCR验证。不同miRNA-mRNA模块的表达结果与深度测序数据相当，而且miRNA和靶基因的表达呈现相反的调控趋势，这与miRNA和靶基因的调控作用一致。这些结果表明qPCR和高通量测序的结果是一致的。

图11.miRNA-mRNA模块的qRT-PCR验证。直方图显示qRT-PCR验证miRNA-mRNA模块的结果，折线图显示miRNA-mRNA模块的序列结果。所有数据将对照组JY_M0h或LS_M0h归一为1。

讨论

microRNA是一种非编码RNA小分子，长度为18-25nt，是转录后的基因调控因子。这些miRNA通过与特定的靶标mRNA相互作用，与植物的生长和发育、植物形态发生、细胞分化以及各种生物和非生物胁迫有关。最近，越来越多的研究表明，miRNAs参与了植物次生代谢产物的调控，如miR5072、miR858、miR156和miR360。利用多种组学方法，如小RNA深度测序和降解组，在芍药、马铃薯和Picrorhizakurroa中发现了一些植物次生代谢产物响应的miRNA。然而，还没有关于冬凌草中miRNAs的鉴定和表达分析的研究。在本研究中，研究者采用了多组学技术，将小RNA、转录组和降解组联系起来，利用深度测序技术系统地研究了冬凌草中的miRNAs，包括MeJA处理的影响。本研究考察了两种不同的冬凌草基因型中的miRNAs和对冬凌草甲素生物合成调控的miRNAs，这些基因型的冬凌草甲素水平不同。研究者的研究共发现了348个miRNA，包括287个已知miRNA和61个新型miRNA。其中，51个miRNA在不同样本中有显著表达，27个miRNA对MeJA有反应。总之，本研究首次利用小RNA高通量测序技术鉴定了冬凌草中的miRNAs，为研究miRNAs对冬凌草生长发育和次生代谢物生物合成的调控奠定了基础。

1miRNA-mRNA模块在冬凌草中具有多种生物学功能

研究者进行了降解组测序，以确定miRNA的靶标。在本研究中，研究者发现了与228个miRNA相关的3066个靶基因。其中，许多靶基因是转录因子，包括GRF、AP2/ERF、HD-Zip、MYB、SPL、DOF、NAC和ARF。这些miRNA-mRNA调节模块包括mtr-miR396b-5p_1ss21GA-GRF9、mtr-miR172b-RAP2-7、aqcMIR396b-p3_1ss9AT-ATHB-15、ly-miR166a-3p_L+2R-2-REVOLUTA、ath-miR858a_L-1R+1-MYB114,mtr-miR159a-MYB80,csi-miR159a-3p_R+3-MYB4,ssl-miR156_R-1-SPL6,mtr-miR156b-5p_L+1-SPL5,stu-MIR408b-p3_1、csi-miR164a-5p-NAC和gmaMIR5368-p3_1ss2GA-ARF5。大量研究表明，转录因子对植物的生长发育、激素信号转导、逆境胁迫和次生代谢产物的生物合成具有重要的调控作用。GRF9作为一种生长调节因子，在调节植物生长、发育和胁迫方面发挥着重要作用。在拟南芥中，miR396主要通过调节GRF3来影响根的生长。在水稻中，miR396可通过靶向GRF来调控水稻对褐飞虱反应的分子机制。RAP2-7属于AP2/ERF转录因子家族。研究表明，AP2/ERF转录因子广泛调控植物的生长和发育，以应对植物胁迫。在大连蓟马中，miR172-AP2可调控花的发育。在大豆中，miRNA172c的过表达或GmNNC1的表达不足可提高大豆的耐盐性。在水稻中，研究发现光色素负调控miR172d可抑制AP2家族中OsIDS1和SNB的表达，从而诱导开花。ATHB-15和REVOLUTA属于HD-Zip转录因子家族。在番茄中，sly-miR166a及其靶基因HD-ZipIII都会对黄叶卷曲病毒感染做出反应，并且它们的表达是对立的。此外，AtSPL9通过激活miR172降低下游类似AP2的开花抑制基因的表达水平，产生miR156-SPL9-miR172-AP2调控模块，促进了大连蓟马的开花。同样，miR156可通过负向调节转录因子SPL9来调节花青素合成基因DRF的表达，并负向调节连花生中花青素的合成。总之，这些结果表明，冬凌草的miRNA-mRNA模块在上述过程中发挥了重要作用。

2参与冬凌草植物激素信号通路的miRNA-mRNA模块

植物激素对植物生长发育、胁迫反应和次生代谢物的生物合成所涉及的信号网络至关重要。特别是，外源施用MeJA可增加或减少各种植物中次生代谢物的积累。在人参中，MeJA增加了人参皂苷和酚类化合物的积累。在铁皮石斛中，MeJA处理可提高芳香化合物的含量。此外，研究表明，MeJA能诱导与次生代谢物合成途径有关的酶的表达。例如，MeJA能显著上调灵芝中HMGR的表达。在罗汉果中，包括SgHMGR、SgSQS、SgCS和SgCYP450在内的罗汉果甙生物合成途径基因都会因MeJA处理而上调。同样，MeJA处理会增加冬凌草中冬凌草甲素次生代谢产物的含量。因此，本研究对MeJA处理后的miRNA水平进行检测，将有助于发现更多与冬凌草甲素合成有关的调控miRNA。以往的研究表明，不同的miRNA在不同的生物过程中调控植物激素相关基因的表达。在本研究中，植物激素信号转导途径（ko04075）由61个miRNAs（包括miR160、miR393、miR167和miR156）靶向的73个靶基因所代表，包含了可通过MeJA处理诱导的茉莉酸、脱落酸、生长素、乙烯和油菜素类脂相关信号转导基因。在茉莉酸信号通路中，茉莉酸抗性1（JAR1）、茉莉酸ZIM结构域（JAZ）和茉莉酸不敏感1（JIN1，或MYC2）蛋白是对MeJA起反应的三个关键受体蛋白。csiMIR393b-p3_1ss10TC和rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA是JAR1蛋白的靶标，通过MeJA处理，它们在冬凌草的JY和LS基因型中的表达量都有所增加。在其他物种中，JAR1可能是不同miRNA的靶标。在番茄中，JAR1蛋白在脱水胁迫下被slymiR827-5p靶向。JAZ蛋白被PC-5p-969_3165靶向，通过MeJA处理，PC-5p-969_3165在冬凌草的JY和LS基因型中的表达也增加了（图6，表S11）。在番茄中，sly-miR169a-5p以JAZ受体为靶标，在干旱处理后的所有组织中的表达量都会下降。JIN1又称MYC2，有6个miRNA的靶标，包括mtrMIR408-p3_2ss18GT19GA、mtr-miR172c-5p_R-3、mtr-MIR2603-p3_2ss9AC17AC、ly-miR393a-5p、gma-miR393a_L+1和gmamiR394a-5p。在鹰嘴豆中，miR408以铜相关基因为靶标，可能会提高耐旱性。在芥菜中，bramiR172b-3p在ATCCS中受到负调控，是一种潜在的Cd2+特异性抗性因子。miR393通过抗性TIR1基因（mTIR1）增强拟南芥的耐盐性。先前的研究表明，miR394以F-box为靶标，在植物生长和发育过程中对胁迫起着重要作用。在水稻中，miR394以编码F-box蛋白的LEAFINCLINATION4（LC4）为靶标，在调节叶片倾斜方面发挥重要作用。总之，在JA信号通路中，miRNA及其相关基因在植物的生长、发育和胁迫中起着关键作用。结合MeJA对次生代谢产物合成的调控，可以推测与JA相关的miRNA及其相关基因调控了冬凌草甲素的合成。此外，不同激素之间也存在相互作用。例如，茉莉酸（JA）在抗病过程中通常与赤霉素（GA）相互作用，在植物生长发育和对非生物胁迫的响应过程中与ABA相互作用。在本研究中，涉及茉莉酸、脱落酸、生长素、乙烯和油菜素类脂相关信号基因的生长素响应因子（ARF）、生长素响应蛋白（IAA）、AUXINSIGNALINGF-BOX（AFB）、磷酸酶2C（PP2C）、EINs、DELLA和BZR基因也对MeJA处理有反应。据推测，这些基因可能直接或间接参与调控冬凌草甲素的合成。

3参与冬凌草中冬凌草甲素生物合成的miRNA-mRNA模块

miRNA在植物次生代谢物的生物合成过程中发挥着重要作用。特别是在药用植物中，次生代谢物主要是有效成分，是治疗效果的基础。目前，已从药用植物中鉴定出多种对次级代谢生物合成具有调控功能的miRNA，包括miR160、miR156、miR5021和miR4995。冬凌草甲素是冬凌草的主要活性成分，属于二萜类化合物，由于其良好的生物活性和较高的药用价值，已被广泛研究。过去，对冬凌草甲素生物合成的研究主要集中在催化酶上。研究miRNA介导的冬凌草甲素生物合成有助于完善冬凌草甲素生物合成调控网络的构建。在本研究中，参与MVA和MEP途径中萜类化合物合成途径上游部分的基因，如AACT、HMGR、DXS、HDS、IspH、FPS和ICMT基因，以及一些中游和下游基因、选择了CPS4、CPS5、KSL5、IrCYP706V2和IrCYP706V7等中下游基因作为鉴定miRNA的靶标基因，并认为这些miRNA参与了冬凌草甲素的生物合成。通过降解组测序，只检测到7个miRNA-mRNA模块，包括7个靶向6个冬凌草甲素生物合成相关基因的miRNA，包括靶向HDS的mtr-miR397-5p_R-1、靶向AACT的mtrmiR172c-5p、靶向HDS的mtrmiR172c-5p、靶向HDS的mtrmiR172c-5p、靶向AACT的mtrmiR172c-5p、stu-miR167d-3p_2ss12TA19CT靶向DXS，ptc-MIR828b-p5_2ss9CG19TA和csi-MIR393b-p3_1ss10TC靶向不同剪接位点的FPS，rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA靶向IspH，smi-MIR12112-p3_2ss17GT18GT靶向HMGR。此外，有151个miRNAs靶向了51个基因，这些基因通过psRNATarget被确定与冬凌草甲素的生物合成有关。结合被miRNAs靶向的靶基因数量，研究者推测miR408、miR167、miR169、miR171和miR156可能在调控冬凌草甲素的生物合成过程中发挥了特定的调控作用。结合之前的研究报告，本研究的发现显示了冬凌草与其他物种的异同。例如，中以AACT为靶标的miR5027；银杏叶中以AACT为靶标的miR167和以HMGR为靶标的miR457；中以FPS和HMGR为靶标的miR414。最终，miRNA对次生代谢产物的调控在不同物种间存在细微差别。有必要进一步探索与桔梗合成相关的调控miRNA，这将为深入分析桔梗合成途径奠定重要基础。

结论

本研究共鉴定了348个miRNAs，包括287个已知的miRNAs和61个新的miRNAs。其中，51个miRNA在不同组中有显著表达，27个miRNA对MeJA有反应。通过降解组测序，共鉴定出与228个miRNA相关的3066个靶基因；其中，降解组数据中的2308个基因被富集到2549个GO_Terms中，降解组数据中的956个基因被注释到128个KEGG通路中。miR397、miR172、miR167和MIR828参与了冬凌草甲素生物合成的调控，其他miRNA如miR408、miR169、miR171和miR156在冬凌草甲素生物合成调控中的作用有待进一步验证。此外，还发现了miR156、miR167、miR393、miR396、miR482和PC-3p-19822_242的靶向调控植物激素信号转导途径。总之，本研究了冬凌草中的miRNA，为miRNA介导的冬凌草生长发育和次生代谢产物生物合成的调控分子机制提供了依据。