本期我们推送的蛋白质结构与功能领域相关的文章来自ACS集团旗下的子刊ACSCatalysis，其主要刊发催化领域的重要研究进展，包研究性文章和综述等，2020年的影响因子为13.084。

1

DecipheringtheReactionPathwayofMononuclearIronEnzyme-CatalyzedN≡CTripleBondFormationinIs

Substrate-BindingModeofaThermophilicPETHydrolaseandEngineeringtheEnzymetoEnhancetheHydrolyticEfficacy

嗜热PET水解酶的底物结合模式并改造酶以提高水解效率

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是生产最广泛的塑料之一，但在环境中积累的大量PET废物已成为对生态系统的严重威胁。高含量的芳香族残基和刚性结构赋予PET对自然降解的高耐受性。应用PET水解酶对PET进行解聚是管理PET污染的一项有吸引力的措施，而寻找更有效的酶是实现这一目标的先决条件。一种源自叶枝堆肥的热稳定角质酶ICCG是迄今为止报道的最有效的PET水解酶。作者对ICCG与PET类似物单（2-羟乙基）对苯二甲酸复合物的晶体结构进行了解析，以揭示酶-底物相互作用网络。此外，通过基于结构的蛋白质工程来修饰ICCG，经过筛选获得了几种熔融温度接近99°C且PET水解活性升高的突变体。最后进行晶体学分析以揭示由引入的突变介导的结构稳定效应。这些结果对于理解耐热PET水解酶的作用机制具有重要意义，将有利于PET生物降解平台的开发。

2

FunctionalandStructuralDissectionofaPlantSteroid3-O-GlycosyltransferaseFacilitatedtheEngineeringEnhancementofSugarDonorPromiscuity

对植物类固醇3-O-糖基转移酶的功能和结构解析增强糖供体底物混杂性

强心类固醇（CTSs）是治疗心力衰竭的古老而有效的临床药物。CTS的糖基化，尤其是C-3位的糖基化，在当今的药理学应用中具有重要意义，因为它可以增加CTS的溶解度、降低其毒性并增强其生物活性。植物类固醇3-O-糖基转移酶(S3GT)是实现CTSC-3糖基化的有利工具。然而尚未确定具有底物和糖供体混杂性的S3GT，植物S3GT识别和催化CTS的机制仍不清楚。在本研究中，作者鉴定和表征了来自药用植物Calotropisgigantea的植物类固醇3-O-糖基转移酶UGT74AN2。UGT74AN2对结构多样的CTS的3-羟基以及N-/S-糖基化活性表现出底物区域特异性和适度的糖供体混杂性。为了揭示植物S3GT的酶促机制并指导其蛋白质工程设计，作者以原子分辨率解析活性状态下UGT74AN2的复杂结构，鉴定了影响糖供体识别和偏好的关键残基，并揭示了一个独特的V形疏水口袋，解释了CTS识别和区域特异性。此外，保守残基Gly23已被证明对酶催化至关重要。基于这些发现，作者构建了一个突变体UGT74AN2I284R/W390H/V391G，其显示出增强的糖供体混杂性。与分别使用UDP-Glc、UDP-GlcNAc或UDP-Gal作为糖供体的野生型相比，突变体的催化活性提高了约1.8倍、7.6倍或11.4倍。此外，UDP-Rha也可以被接受作为糖供体，转化率约为55%。

3

AChemoenzymaticStrategyfortheSynthesisofSteroidDrugsEnabledbyP450Monooxygenase-MediatedSteroidalCoreModification

P450单加氧酶介导的类固醇核心修饰实现类固醇药物合成的化学酶策略

通过类固醇核心的多级修饰合成类固醇药物具有挑战性，因为涉及位点特异性和选择性修饰，这对于化学催化来说是困难或复杂的。群勃龙(3)是一种多功能合成代谢-雄激素类固醇，其核心修饰estra-4,9-diene-3,17-dione(1)依赖于四步化学过程。在本研究中，作者设计了一个两步化学酶策略，包括生物催化一锅C11-羟基化/17β-酮还原1，使用计算设计的P450单加氧酶和适当的17-酮类固醇还原酶生成11α-OH-9(10)-dehydronandrolone(2a)作为中间体，然后进行化学脱水以在C11和12处引入双键，形成群勃龙(3)。为了获得高活性和C11选择性的酶，进行了分子动力学模拟，揭示了水分子在底物识别和类固醇靶向羟基化中的关键作用。此外，群勃龙进一步酯化生成醋酸群勃龙（9），已广泛应用于兽药领域。最后，作者提出以一种方法，能够在克规模上区域选择性和立体选择性合成类固醇药物3和9，分离产率为83-91%，显示出巨大的工业应用潜力。

4

DecipheringtheReactionPathwayofMononuclearIronEnzyme-CatalyzedN≡CTripleBondFormationinIsocyanideLipopeptideandPolyketideBiosynthesis

破译单核铁酶催化异氰化物脂肽和聚酮化合物生物合成中N≡C三键形成的反应途径

近年来发现2-氧代戊二酸依赖性非血红素铁(Fe/2OG)酶能够催化多种多样反应，但仅对有限数量的相关酶进行了深入研究。已经几种Fe/2OG依赖性酶能够催化异氰化物形成的报道。虽然甘氨酸部分已被确定为异氰化物基团的biosynthon，但如何实现转化仍不清楚。为了阐明催化机制，作者表征了两种先前未鉴定的（AecA和AmcA）以及两种已知的（ScoE和SfaA）Fe/2OG依赖性酶，它们利用合成的底物类似物和潜在的中间体催化形成N≡C三键。结果表明，异氰化物的形成可能需要一个涉及亚胺中间体的两步反应，该亚胺中间体经历脱羧辅助去饱和产生异氰化物产物。诱变、产物结合酶结构和计算机分析进一步支持了从体外实验获得的结果。

5

AnEnzymewithHighCatalyticProficiencyUtilizesDistalSiteSubstrateBindingEnergytoStabilizetheClosedStatebutattheExpenseofSubstrateInhibition

一种具有高催化能力的酶利用远端位点底物结合能但以底物抑制为代价来稳定闭合状态

了解支撑酶巨大催化能力的因素是催化和酶设计的基础。部分酶能够通过利用源自底物的非反应部分的结合能来实现高催化能力。催化远端位点配位的含有非反应性磷酸二阴离子基团的底物的酶，主要利用这种结合能来促进从开放的非活性形式到封闭的活性形式的构象变化，而不是通过诱导基态不稳定或稳定转变状态。然而，该模型的详细结构证据仍然有限。在本研究中，作者使用β-磷酸葡萄糖变位酶(βPGM)来研究在远端部位结合磷酸二阴离子基团、采用封闭的酶形式和催化能力之间的关系。βPGM通过近端位点的磷酸转移反应催化β-葡萄糖1-磷酸异构化为葡萄糖6-磷酸，同时在远端位点配位底物的磷酸二阴离子基团。βPGM具有强大的催化能力，并且在其催化循环期间经历了显着的域闭合。远端位点的侧链取代导致底物结合减少，从而使封闭的活性形式不稳定，但又不足以阻止形成完全封闭的近过渡态构象。此外，作者发现即使在近端位点没有转移磷酸基团的情况下，远端位点的磷酸二阴离子基团的结合也会刺激结构域闭合。最后，研究结果表明具有高催化能力且涉及磷酸化底物酶对稳定封闭活性形式具有更大的要求。

6

DiscoveryandRedesignofaFamilyVIIICarboxylesterasewithHigh(S)-SelectivitytowardChiralsec-Alcohols

发现并重新设计对手性仲醇具有高(S)选择性的VIII家族羧酸酯酶

高度对映选择性脂肪酶已广泛用于通过动力学或动态动力学拆分制备多功能对映纯手性仲醇。脂肪酶一般是(R)-选择性的，很难获得(S)-选择性脂肪酶。VIII族羧酸酯酶的最新晶体结构表明，其催化三联体的空间结构是脂肪酶的镜像，但又不同于脂肪酶。因此，作者假设VIII族羧酸酯酶可能对仲醇表现出(S)-对映选择性，类似于(S)-选择性丝氨酸蛋白酶，其催化三联体也在空间上排列为镜像。在本研究中，作者制备了一种已知的家族VIII羧酸酯酶（pdb代码：4IVK）的同源酶（来自变形杆菌属细菌SG_bin9，PBE的羧酸酯酶），其不仅显示出对仲醇例如3-butyn-2-ol和1-苯乙醇的中等(S)-选择性，而且对特定的仲醇也有（R）选择性。此外，基于分子模型的合理重新设计显着提高了PBE的(S)-选择性。分子模型确定了一个由Ser381、Ala383和Arg408组成的，用于(R)-1-苯乙基乙酸酯甲基取代的结合口袋，并表明较大的残基可以通过干扰慢反应对映异构体的结合来增加对映选择性。如预测的那样，用更大的残基（Phe、Tyr和Trp）取代Ser381显着提高了PBE对所探索仲醇的(S)-选择性，甚至是野生型PBE表现出(R)-选择性的底物。