今天推送的文章发表在ACSCatalysis的“ChemoenzymaticSynthesisofPhenolDiarylamineUsingNon-HemeDiironN-Oxygenase”，通讯作者为河南师范大学化学化工学院的郭远洋副教授。

将碳-氮键引入芳烃是许多有价值化学品的基本合成策略。二芳基胺，其中两个芳基环通过C–N–C键连接，是药物、农用化学品、染料和工业材料中的多功能构建原件（图1A）。此外，二芳基胺是合成咔唑、吖啶、吲哚、二苯并氮杂等的有用中间体。二胺合成的代表性反应包括Buchwald–Hartwig偶联和Cham–Lam交叉偶联反应。最近有研究报道了电化学和无金属二胺合成方法。芳基C–H直接转化为C–N可能是最方便的方法，但仍是化学合成中的挑战。用于二芳胺合成的酶促C–N键形成可能是一种绿色可行的解决方案。

非血红素二铁N-加氧酶AzoC在Streptomyceschattanogensis的偶氮霉素生物合成过程中催化芳香胺直接四电子氧化为亚硝基类似物（图1D）。在偶氮霉素生物合成中，AzoC（亚铁形式）的二铁中心吸收分子氧，使胺氧化为亚硝基中间体，继而二铁中心转变为非活性铁形式，然后其被还原为活性铁形式使胺硝基氧化。芳香亚硝基化合物是C–N和N–N键合成中的活性中间体。在C–N键形成过程中，芳香族亚硝基基团通常充当亲电试剂；而富电子苯如苯酚衍生物作为亲核试剂；同时，反应条件显著影响反应活性。因此，作者研究了是否可以通过控制反应条件将AzoC生成芳香亚硝基的活性用于二芳胺合成中C–N键的构建。

作者使用2-萘酚（2）作为亲核试剂，对氨基苯甲酸（1）作为胺源，开始研究是否有可能在亚硝基生成步骤中停止AzoC的活性，与富含电子的苯酚化合物级联用于后续反应（图2A）。作者表达并纯化了AzoC，并进行了亚硝基生成反应和对照反应。使用GDH作为NADH再生系统，并使用甲磺酸吩嗪（PMS）作为电子媒介，以再生二铁加氧酶铁中心的活性形式（二铁形式）。结果形成了主要产物亚硝基中间体3和痕量副产物4（图2B）。当向反应体系中加入2时，观察到保留时间为15min的新峰（图2B），即苯酚二芳胺产物5（图2C），是HIV整合酶和淀粉样蛋白聚集的有效抑制剂。

优化反应条件

温度、添加剂、pH和缓冲溶液对5产量的影响见表1。当反应在25℃的PBS缓冲液（pH8）中进行1h时，5的产率从36%（表1，2）增加到82%（表1，7）。在pH值高于11或低于6时，未观察到5的产生；因此，pH被认为是该反应的关键因素。在该反应体系下，还分离出4，由3以一种自由基的机制非酶二聚化形成4。非酶二芳基胺和偶氮氧基合成竞争消耗3（图S2）。因此，2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基（TEMPO），一种自由基清除剂和聚合抑制剂，被用于阻断偶氮氧基合成分流并提高5的产率。当向反应体系中加入10mol%的TEMPO时，5的产率增加到97%（表1，13和图2B）。

在最佳反应条件下，作者测试了苯胺底物范围。首先测试了对羧基取代的苯胺底物（15b），发现它们全部转化为二芳基胺产物，具有良好的产率（图3、5和5-1a至5-1e）。然后测试了p-取代的三氟甲基（强吸电子基团）和甲氧基（强给电子基团）底物，并以良好的产率获得了二芳胺产物5-1f和5-1g（图3）。然而，间位和邻位取代的苯胺底物不被AzoC接受。

蛋白质工程以扩大底物范围。

非血红素二铁N-加氧酶AurF显示出更宽的底物范围和与AzoC的39%同一性，Y93、V97、T100、N200和R302残基参与底物结合。因此，作者在AzoC的相应Y94、T98、L101、N203和Q304残基上构建了突变体库，并测试了对p-、m-和o-位取代苯胺底物的活性。结果获得了一个突变体AzoC-T98V-L101T（AzoCII），它识别p-和m-取代的底物（图3、5和5-1a至5-1i），表明其对苯胺底物的广泛兼容性。

然后作者研究了AzoC-II的苯酚底物范围。首先研究了2对该反应的诱导影响。2的强吸电子溴基团和强给电子甲氧基修饰的类似物与反应相容，获得了良好至优异的产率（图3，5a-5d）。溴修饰底物的产率低于甲氧基修饰的底物，这表明酚的电子状态对该反应有潜在影响。然后，作者测试了其他酚类是否耐受这种酶促二胺偶联反应。结果以优异的产率成功分离1-萘酚和6（CCDC2124158）。随后进一步测试了其他双环酚。喹啉醇底物8-羟基喹啉和6-羟基异喹啉在我们的反应条件下是相容的，并且以良好的产率生成了相应的产物7（CCDC2124159）和8。

对于吲哚底物，4-羟基吲哚和5-羟基吲哚，生成了未识别的不溶性沉积物，而不是二胺产物10和11，这可能是由吲哚吡咯环上的活性仲胺引起的。因此使用N-Boc保护的4-羟基吲哚作为苯酚底物，以23%的产率分离出10，其中大部分N-Boc-保护的4-羟吲哚未转化，表明吲哚作为苯酚芳香源的兼容性。对单环苯酚如对苯二酚、4-（二甲氨基）苯酚和苯酚也进行了测试，结果以良好的产率成功地分离出氢醌二胺产物9。对于4-（二甲氨基）苯酚和苯酚，当反应时间延长至12h时，仅生成亚硝基产物3和偶氮氧基产物4，而不是分离预期的二胺12和13。由于苯酚的电子状态影响反应，可能是苯环上相对较低的电子密度阻碍了12和13的形成。

先前研究表明，NADH可以介导芳香族亚硝基化合物转化为其羟胺类似物，这两者都是活性氮源。因此，作者首先确定了二胺产品的实际氮源。使用市售的亚硝基苯和苯基羟胺（图4A,1f和1g）进行非酶反应（用50μM2、1mMNADH和5μMTEMPO在25°C的20mMpH8PBS缓冲液中分别与1f和1g孵育1h），结果产率分别为98%和11%，表明亚硝基化合物是真正的氮源。

基于这些研究和先前的酶机制研究，作者提出了图4B中的反应机制。在酶促过程中，GDH系统提供持久的NADH，以促进PMS和还原的PMS之间的循环；然后，还原的PMS充当化学电子介体以再生AzoC的活性中心；AzoC的循环铁中心吸收氧气并以循环方式催化苯胺氧化为亚硝基中间体。在非酶过程中，部分带正电荷的亚硝基氮原子与苯氧离子的带负电荷的碳中心偶联，形成C–N键，然后NADH将N–O键还原为N–H键，生成二芳胺产物（图4B）。