文|云霄钰
编辑|云霄钰
达到性成熟是生命中一个重要的过程，在此性器官和性腺发育迅速，导致获得生育。探索动物性成熟度的发生、过程和判断标准，对于了解物种的生理变化和指导其繁殖具有重要的科学和经济价值。各种研究性成熟已经进行了广泛的物种，如RM，大西洋鲑鱼，大西洋蓝金枪鱼，加勒比鱼，通心粉企鹅，北方海豹和野猪。
作为一种具有与人类相似的遗传背景、系统发育和生理的模型动物，对人类生理、疾病和行为的研究做出了巨大贡献。
随着对圈养鼠的需求不断增加，如何基于准确的性成熟标准有效地指导育种已成为一个关键问题。圈养研究表明，雄性猕猴的性成熟应该通过精液样本中的精子来判断，而雌性猕猴的性成熟应该通过至少两个连续的月经周期来判断。
然而，这些判断可能是不准确的和不可控制的，因为男性的漏精液和女性的月经可能并不总是容易被检测到。用于性激素分析的血液样本也可以用来确定性成熟度，但频繁的取样增加了程序的复杂性。人们还提出了一些决定性成熟的替代参数，包括年龄、体重和睾丸体积，但由于个体间的大变异，不能可靠地预测非人类灵长类动物的性成熟。因此，有必要探索更简单、更准确的方法来判断猕猴的性成熟度。
随着高通量测序技术的发展，多组学数据有助于从多个角度探索生物过程，包括基因组学、转录组学、代谢组学、微生物学和蛋白质组学。利用多组学分析探索了药物对猕猴的作用，极大地促进了生物医学研究。
例如，多组学研究表明，抗疟药物乙胺嘧啶抑制RM免疫系统的细胞分裂和代谢，影响免疫生理学。
Xu等人通过对转录组、代谢组和宏基因组的联合分析，发现老年RMs中色氨酸相关基因、代谢物和肠道微生物组发生了显著变化。多组学也可以简单比较多个研究个体之间的差异，以揭示生物相关物质对生命的影响和生命过程的机制。Yue等人通过比较男女男婴的血液转录组数据，发现X染色体上有3个不同表达基因，Y染色体上有14个不同表达基因。
此外，血液转录组分析显示了西藏猕猴和人类之间的基因表达模式的相似性和差异性，为灵长类动物的进化提供了新的见解。蛋白质组学和转录组学分析揭示了脂肪酸结合蛋白4在猕猴[23]饮食诱导的糖尿病发病机制中的作用。
对特发性慢性腹泻猕猴粪便的元转录组学分析有助于阐明疾病过程，涉及粘蛋白降解和聚焦利用的变化。此外，多组学已广泛应用于人类性成熟度的研究。Aksnes等人检测到人血液中与维生素D相关的代谢物，发现青春期血液中维生素D的浓度与性成熟[25]密切相关。
Almstrup等人分析了代谢组和甲基化数据，发现代谢物内分泌干扰物水平与青春期前后血液DNA甲基化谱相关，表明环境化学物质可能改变青少年发育。然而，在性成熟方面，同一物种的个体之间的生理变化有很大的差异。
在这里，我们的目的是通过多组学方法分析性成熟前后的变化来确定可靠的标记，以帮助判断RMs的性成熟。该研究为圈养鼠性成熟的判断和机制提供了新的见解，有助于繁殖和繁殖。我们的研究策略和研究结果也适用于野生种群，甚至其他受保护的动物。
材料和方法：动物管理共将28只猕猴分为4组：6只无射精行为的性不成熟雄性猕猴；9只有繁殖经验的性成熟雄性猕猴；7只无月经行为的性不成熟雌性猕猴(FNS；1.5岁）；6只有繁殖经验的性成熟雌性猕猴。所有RMs均为来自四川温室生物技术有限公司的圈养个体，并在相同的条件下饲养在完整的社会群体中，所有的个体在实验过程中都可以自由地吃喝。
为了获得每个个体的血液样本和新鲜粪便样本，每组的rm在取样前一天被关在一个笼中。采用PAXgene血液RNA管采集血样23例，非麻醉肝素抗凝管血浆24例，血液和血浆样本均为2ml。所有取样容器应轻轻翻转6-8次，然后暂时放入冰箱中。
在动物排便后尽快采集粪便样本，去除表面污染物后，将21份粪便样本置于无菌离心管中。下一个样品需要更换一次性手套。所有血液和粪便样本均在−80°C下保存。
将RNA样本送至诺夫烯，使用IlluminaNovaSeq6000平台进行对端测序，平均获得58,230,463.9条原始reads。通过质量控制和读取映射，使用NGSQC工具包和分别获得57,954,233.86fnal高质量读取。采用TeDESeq2R包进行DEG筛选，认为基因为p为0.05和log2倍变化1的DEG。
代谢组数据库分析血浆样本用于代谢组学研究。解冻后直到没有冰，样品用300μL纯甲醇涡旋3min，并在12000rpm和4℃下离心10min。收集Te上清液，在−20℃冷冻30min，12000rpm离心3min，4℃，上清液150μL用于液相色谱串联质谱分析分析。
采用超性能液相色谱和四极杆时间距离质谱进行于LC-QTOF-MS/MSSCIEX实验。采用自建立的目标标准数据库MWDB和集成的公共数据库MHK进行准确的定性和定量分析。采用单变量和多维分析的方法筛选不同表达的代谢物。
以双尾非配对t检验得到的Tep值和偏最小二乘判别分析模型得到的变量注入投影值为主要因素，以和VIP1作为DEMs的筛选标准。
提取的DNA样本送至诺维烯，在NovaSeq6000平台上进行配对测序。在去除适配器、低质量的原始reads和宿主污染后，我们使用原生代[34]和CD-HIT进行了基因预测和非冗余构建。采用Kraken2和线性判别分析差异大小对关键物种进行物种注释和筛选。
利用金刚石[38]构建dbCAN数据库和碳水化合物活性酶注释。利用HUMANn3对物种的功能组成和基因家族和通路进行定量分析。使用QIIME2计算alpha和beta多样性。
由两个尾非配对t检验得到的Tep值，表示显著偏差，fgures中的“∗”表示。相关分析采用Spearman相关分析，|相关系数|0.8为高相关性。通过GraphPadPrism8从受试者工作特征曲线中得到曲线下面积。AUC值在0.7~0.9之间表示该生物标志物具有一定的诊断准确性，在0.9以上表示该生物标志物具有较高的诊断准确性。
结果：良好的微生物群将4组的Te肠道菌群分为82个门、685科、2632属和8973种。在门水平上，MS、MNS和FNS组中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门占优势，而FS组中厚壁菌门、拟杆菌门和螺旋体门占优势。
在属水平上，FNS组占乳酸菌、粪杆菌和普雷氏菌；FS组占乳酸菌、链球菌和短螺旋菌；链球菌、粪杆菌和巨孢菌，MS组为乳酸菌、粪杆菌、链球菌。
MS组中乳酸菌、乳杆菌、弯曲杆菌和鸟腺病毒的Te相对丰度高于MNS组。FS组的偶氮螺旋菌、红球菌、双歧杆菌和节肢杆菌的Te相对丰度均高于FNS组。Te微生物代谢途径显示，MS组中氨基酸和脂质生物合成相关途径减少，包括支链氨基酸生物合成超途径、芳香族氨基酸生物合成超途径和脂质IVA生物合成。
在FS组中，脂肪酸的生物合成和丙酮酸发酵途径增加，包括gdp-甘露糖衍生的o抗原构建块生物合成和丙酮酸发酵到醋酸和(S)-乳酸I的超途径。此外，CAZy酶家族的糖基转移酶均为FS组表达显著上调。然而，MS组和MNS组之间的CAZy酶家族无明显变化。
Tealpha-多样性结果显示，MS组和MNS组之间的ACE、赵1、香农和辛普森指数没有显著差异，而FS组的ACE和Chao1指数明显低于FNS组。
在这项研究中，我们进行了多组学分析，以表征性成熟前后RMs的变化和识别潜在的生物标志物。在MS猕猴中，我们鉴定出了多种与精子发生相关的DEGs，包括TSSK2、HSP90AA1、SOX5、SPAG16和SPATC1。
睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸激酶2只在精子细胞中表达，是TSSK家族的一员，在男性生育能力中发挥重要作用。
双敲除TSSK1/TSSK2导致小鼠精子发育异常。热休克蛋白90是影响哺乳动物精子减数分裂后分化的关键因素。靶向破坏HSP90AA1基因可导致小鼠的雄性不育。此外，HSP90可以防止TSSKs的泛素化和降解，对其激活[至关重要。
精子相关抗原16L是SPAG16的主要转录亚型，编码与纤毛/胃菌形成和运动相关的蛋白。SPAG16L防御可导致男性不育，与精子活力受损相关。短SRY-box转录因子5是SOX5转录本的一种形式，在减数分裂后的圆形精子细胞中表达。
S-SOX5可能通过激活SPAG16L参与运动纤毛/纤维菌的形成。同样，下调精子发生和中心粒相关1基因可以降低精子的生育能力，尽管SPATC1的确切功能尚不清楚。因此，这些DGEs的上调在我们的研究中表明，MS猕猴具有更好的精子生育能力，这是性成熟的一个重要标准。
在FS猕猴中，基质金属蛋白酶家族成员MMP9表达下调。MMPs参与各种生理过程，如排卵。促黄体生成素和促卵泡刺激素是维持猪颗粒细胞[54]中MMP9转录的重要因素。然而，LH和类固醇可以抑制RMs中MMP9的表达。基质金属蛋白酶Te降低提示FS组LH和类固醇水平可能升高。
此外，我们还发现FS组的雌酮和肾上腺素显著降低，这与人类研究中报道的情况相似。游离脱氢表雄酮和雄烯二酮的浓度增加，这两种性激素主要来自肾上腺，在青春期发育期间先于性腺相关激素的增加。在性成熟之前，雌激素可能通过卵巢活性有限的脂肪组织中的肾上腺激素外周转化。在我们的研究中，FNS组的肾上腺素外周转换中的主要雌激素水平较高。
通过多组学分析，我们观察到个体在性成熟前后与胆固醇和色氨酸代谢相关的两个显著差异。胆固醇作为肾上腺皮质、雌激素和雄激素的前体，在性成熟过程中是必不可少的。
在猕猴中，胆固醇是公认的男性生育能力的调节因子，而胆固醇稳态对精子成熟的[62]至关重要。在这里，在MS组中，与胆固醇转运相关的CD36的表达降低。内源性CD36介导天然低密度脂蛋白的内吞作用，这是胆固醇转移所必需的。
细胞内高胆固醇可以通过抑制低密度脂蛋白受体基因[65]的表达来降低胆固醇的摄取。CD36表达降低可能导致血浆胆固醇升高，这表明雄性猕猴在性成熟后，胆固醇可以在性器官中合成各种类固醇
与转录组结果一致，MS组血浆胆固醇水平升高。为了维持体内的稳态，过量的胆固醇可以通过胆汁酸合成途径进行代谢。胆固醇对于初级胆汁酸的合成至关重要，初级胆汁酸产生次级胆汁酸，由微生物群调节。初级胆汁酸通过微生物解耦和7α-去羟基化转化为次生胆汁酸肠道的。微生物解耦包括去除甘氨酸或牛磺酸偶联物，主要由具有胆盐水解酶活性的细菌完成。
研究表明，BSH几乎存在于人类肠道中的所有主要细菌中，包括乳酸杆菌、双歧杆菌和梭菌。细胞毒性胆汁酸的微生物代谢有助于通过粪便消除。
在我们的研究表明，表达bsh的乳酸菌丰度增加，血浆次生胆汁酸降低，表明MS猕猴比MNS猕猴具有更好的抗性。同样，FS猕猴的CD36水平下调，尽管与FNS相比，血浆胆固醇没有显著差异组此外，在FS猕猴中表达bsh的bifdo细菌增加。
结语总之，我们应用多组学分析研究了圈养RMs性成熟前后的变化，发现了不同表达的微生物群、代谢物和参与胆固醇和色氨酸代谢的基因之间的许多潜在联系。
值得注意的是，雌性和雄性猕猴在性成熟前后均有与胆固醇代谢相关的变化，而与色氨酸代谢相关的变化主要发生在雌性猕猴身上。简而言之，MS猕猴比MNS猕猴表现出更强的精子生育能力和胆固醇代谢，而FS猕猴比FNS猕猴表现出更强的神经调节能力和肠道免疫能力。
此外，基于多组学分析的结果和方便的样本收集，我们建议乳酸菌和双歧杆菌可作为性成熟的潜在标记。我们探索了性成熟前后生殖m的变化，并确定了一些潜在的生物标志物，可能指导成熟生殖m的筛选。
